Um mehr über das Erbgut der verschiedensten Lebewesen herauszufinden wird, deren DNA sequenziert. Dabei wird die Abfolge der Nukleotiden ermittelt, um die daraus resultierende Sequenz genauer untersuchen oder analysieren zu können. Wie die Technik der DNA-Sequenzierung funktioniert, erfährst du in diesem Tafelbild.
Bildung der DNA-Fragmente
Im ersten Schritt der DNA-Sequenzierung werden Prinzipien der DNA-Replikation ausgenutzt um, möglichst viele DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge zu erhalten. Die DNA wird einzelsträngig gemacht (denaturiert), der Primer wird gebunden und die Polymerase startet mit der Polymerisation des Gegenstrangs. Das Vorgehen ist dabei jenem der PCR sehr ähnlich. Wobei abgesehen von den ddNTPs auch die gleichen Bestandteile benötigt werden.
- ddNTPs
Di-deoxinukleotidtriphosphate (zweifach deoxidierte Nukleotide) im Gegensatz zu den "normalen" dNTPs welche von der Polymerase zur Verlängerung der DNA-Sequenz gebraucht werden, verfügen ddNTPs über keine Hydroxygruppe (-OH) am 3'C-Atom des Riboserings. Dies führt dazu, dass nach deren Einbau keine weitere Nukleotide von der Polymerase mehr angehängt werden kann und der DNA-Strang an dieser Stelle endet. Zusätzlich sind die ddNTPs je nach angehängter Base mit einer unterschiedlich fluoreszierenden Chemikalie markiert welche in einem späteren Schritt vom Detektor erkannt wird. - Alle weiteren Bestandteile des ersten Schrittes, sowie deren Funktion werden im Tafelbild PCR erklärt.
Dank den ddNTPs werden also viele unterschiedlich lange DNA-Fragmente erzeugt, die alle eine fluoreszierende Markierung auf ihrer letzten Nukleotide tragen. Damit die Fragmente nicht alle zu kurz werden, ist das Verhältnis zwischen dNTPs und ddNTPs etwas 100:1.
Gelelektrophorese
Um die Fragmente unterschiedlicher Länge zu untersuchen, werden diese auf 96°C erhitzt damit sie denaturieren und sie als Einzelstrang vorliegen. Die Probe wird nun auf ein Gel geladen, an dem eine elektrische Spannung angehängt ist. Da die DNA aufgrund ihres Zucker-Phospat-Gerüstes über eine negative Ladung verfügt, wandern die DNA-Fragmente im Gel zum positiven Pol. Die DNA kann das Gel jedoch nicht einfach passieren und wird gebremst. Dieser Effekt ist bei grossen DNA-Fragmenten stärker, so dass kleinere Fragmente in einer bestimmten Zeit mehr Strecke zurücklegen, als grössere. Als Konsequenz daraus werden die DNA-Fragmente auf dem Gel anhand ihrer Grösse sortiert
Lesen der Sequenz
In der Reihenfolge vom kleinsten zum grössten DNA-Fragment passieren diese nun einen Laser und einen Detektor. Der Laser regt die fluoreszierende Markierung an, welche wiederum Licht einer gewissen Wellenlänge emittiert, welches vom Detektor empfangen und von einem Computer in ein Resultat umgewandelt wird. Als Resultat wird die Reihenfolge der detektierten Farben, sowie der entsprechenden Basen angegeben. Mit dieser Methode können Sequenzen von einigen Hundert Basenpaaren länge analysiert werden.
Um längere Abschnitte zu sequenzieren, muss der Vorgang für verschiedene Abschnitte der DNA wiederholt werden, so dass die resultierenden Sequenzen i. d. R. von einem Computer überlappt und zusammengefügt werden.
Die hier gezeigte Methode ist nicht mit der aus den 70er Jahren Stammenden Methode nach Sanger identisch, die leider noch immer in vielen Lehrbüchern als Beispiel für die Sequenzierung vermittelt wird, in der heutigen Forschung jedoch kaum noch Anwendung findet. Das Sequenzieren der DNA läuft heute in den wesentlichen Schritten automatisiert ab und wird hier deshalb auch so erklärt.
